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大鼠原代食管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟
發(fā)表時(shí)間：2025-07-08
大鼠原代食管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟
在完成大鼠原代食管上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)后，接下來的實(shí)驗(yàn)步驟需進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞狀態(tài)，并開展相關(guān)功能研究。以下是后續(xù)關(guān)鍵操作流程：
1. 細(xì)胞換液與觀察
接種24小時(shí)后，在超凈工作臺(tái)中輕柔吸棄舊培養(yǎng)基，避免擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗），置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，健康的原代細(xì)胞應(yīng)呈鋪路石樣緊密排列，若出現(xiàn)懸浮顆粒或大量脫落，需排查污染或消化過度問題。
2. 首次傳代處理
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕柔沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分鐘。鏡下見細(xì)胞間隙增大后立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，按1:2比例接種至新培養(yǎng)瓶。原代細(xì)胞對(duì)酶敏感，需嚴(yán)格控制消化時(shí)間。
3. 功能實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
傳代后的細(xì)胞需穩(wěn)定24小時(shí)再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)或Transwell遷移 assay，需提前將細(xì)胞接種于6孔板或小室中，待融合至60%-70%時(shí)操作。對(duì)于屏障功能研究，可選用Transwell體系培養(yǎng)至形成緊密連接，通過測(cè)量跨膜電阻（TEER）評(píng)估完整性。
4. 凍存與質(zhì)量控制
選取狀態(tài)良好的P2代細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞懸液與凍存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分裝至凍存管，程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮。復(fù)蘇后需檢測(cè)細(xì)胞活性（臺(tái)盼藍(lán)染色＞85%）及角蛋白19免疫熒光鑒定上皮源性。
?注意事項(xiàng)
- 原代細(xì)胞壽命有限，建議在P3代內(nèi)完成關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)；
- 所有操作避免反復(fù)開蓋，以防pH波動(dòng)影響細(xì)胞狀態(tài)；
- 功能實(shí)驗(yàn)需設(shè)3次以上生物學(xué)重復(fù)以確保數(shù)據(jù)可靠性。
在完成大鼠原代食管上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)后，接下來的實(shí)驗(yàn)步驟需進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞狀態(tài)，并開展相關(guān)功能研究。以下是后續(xù)關(guān)鍵操作流程：
1. 細(xì)胞換液與觀察
接種24小時(shí)后，在超凈工作臺(tái)中輕柔吸棄舊培養(yǎng)基，避免擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗），置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，健康的原代細(xì)胞應(yīng)呈鋪路石樣緊密排列，若出現(xiàn)懸浮顆粒或大量脫落，需排查污染或消化過度問題。
2. 首次傳代處理
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕柔沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分鐘。鏡下見細(xì)胞間隙增大后立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，按1:2比例接種至新培養(yǎng)瓶。原代細(xì)胞對(duì)酶敏感，需嚴(yán)格控制消化時(shí)間。
3. 功能實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
傳代后的細(xì)胞需穩(wěn)定24小時(shí)再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)或Transwell遷移 assay，需提前將細(xì)胞接種于6孔板或小室中，待融合至60%-70%時(shí)操作。對(duì)于屏障功能研究，可選用Transwell體系培養(yǎng)至形成緊密連接，通過測(cè)量跨膜電阻（TEER）評(píng)估完整性。
4. 凍存與質(zhì)量控制
選取狀態(tài)良好的P2代細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞懸液與凍存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分裝至凍存管，程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮。復(fù)蘇后需檢測(cè)細(xì)胞活性（臺(tái)盼藍(lán)染色＞85%）及角蛋白19免疫熒光鑒定上皮源性。
?注意事項(xiàng)
- 原代細(xì)胞壽命有限，建議在P3代內(nèi)完成關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)；
- 所有操作避免反復(fù)開蓋，以防pH波動(dòng)影響細(xì)胞狀態(tài)；
- 功能實(shí)驗(yàn)需設(shè)3次以上生物學(xué)重復(fù)以確保數(shù)據(jù)可靠性。
